Dans la vague de détection de la biologie moléculaire, le détecteur PCR quantitatif fluorescent, avec ses avantages de base de haute sensibilité, de haute spécificité et de quantification précise, est devenu un équipement de base indispensable dans les domaines de l'expérimentation scientifique, du diagnostic clinique, de la surveillance de la sécurité alimentaire et d'autres domaines. Du dépistage des acides nucléiques viraux lors de la nouvelle pandémie de covid - 19 au diagnostic précoce des maladies génétiques, en passant par la traçabilité des ravageurs et des maladies des cultures, il agit comme un « détecteur moléculaire a » capable de capturer avec précision les modifications infimes des molécules d'acides nucléiques, fournissant un support de données fiable Pour toutes sortes de tâches de détection. Cet article vous donnera un aperçu du fonctionnement, de la composition de base, des scénarios d'application et des tendances technologiques des détecteurs PCR quantitatifs à fluorescence.

　I. principe de base du détecteur PCR quantitatif Fluorescent: une percée de la « qualité» à la « quantification»

Pour comprendre la logique de fonctionnement d'un détecteur PCR quantitatif par fluorescence, il faut d'abord passer en revue les bases des techniques PCR traditionnelles. Le cœur de la technologie PCR (Polymerase Chain Reaction) est l'amplification exponentielle du fragment d'acide nucléique cible par un processus cyclique de dénaturation à haute température, de recuit à basse température, d'extension à température moyenne, permettant une réplication massive de traces d'acides nucléiques. Mais les techniques PCR traditionnelles ne permettent qu'une détection qualitative finale des produits amplifiés et ne permettent pas de déterminer avec précision la concentration du gabarit initial.

La technologie PCR quantitative par fluorescence (PCR en temps réel) s'appuie sur la PCR traditionnelle et introduit un module de détection de signaux fluorescents, permettant de « synchroniser le processus d'amplification avec la détection de signaux». Le principe de base est le suivant: l'ajout d'un groupe Fluorescent dans le système réactionnel PCR produit un signal de fluorescence correspondant à mesure que le fragment d'acide nucléique cible augmente au cours de l'amplification PCR. Le détecteur PCR quantitatif de fluorescence trace une courbe de l'intensité de fluorescence en fonction du nombre de cycles en surveillant l'intensité du signal de fluorescence à chaque cycle en temps réel. Lorsque l'intensité du signal de fluorescence atteint un seuil prédéterminé, le nombre de cycles correspondent est appelé valeur CT (cycle Threshold). Étant donné que la valeur de CT est inversement corrélée à la concentration de l'acide nucléique Template initial - plus la concentration initiale de Template est élevée, moins le nombre de cycles nécessaires pour atteindre le seuil est élevé, il est possible de calculer avec précision la concentration initiale de l'acide nucléique cible dans l'échantillon en convertissant la courbe standard.

Selon le mécanisme de génération du signal de fluorescence, les techniques de PCR quantitative de fluorescence sont principalement divisées en deux catégories: l'une est la méthode de colorant, telle que sybr Green I, où le colorant peut se lier de manière non spécifique à l'ADN double brin, plus le produit amplifié est élevé, plus le signal de fluorescence est fort; Une autre classe est la méthode de sonde, telle que la sonde Taqman, où la sonde se lie spécifiquement à la séquence cible et ne libère un signal de fluorescence que lorsque la sonde est dégradée par la polymérase au cours de l'amplification, avec une spécificité plus élevée et adaptée à la détection simultanée de plusieurs cibles.

　　II. Composition de base du détecteur PCR quantitatif Fluorescent: coopération des composants de précision a - War

Les détecteurs PCR quantitatifs à fluorescence sont des dispositifs de précision intégrant des algorithmes optiques, thermodynamiques, électroniques et logiciels dont les composants de base s'imbriquent pour assurer la précision et la stabilité de la détection. Il comprend principalement les modules clés suivants:

1. Module de contrôle de la température: le "thermosteward" pour l'amplification PCR

Le module de contrôle de la température est au cœur de la garantie du bon déroulement de la réaction PCR et nécessite une mise en œuvre précise du contrôle cyclique de la température de « dénaturation (environ 95 ℃), recuit (environ 55 - 65 ℃), extension (environ 72 ℃) ». La technologie de contrôle de la température courante est le contrôle de la température à semi - conducteur palladien, associé à un capteur de température et à un algorithme de haute précision, qui peut atteindre un réchauffement et un refroidissement rapides (le taux de réchauffement peut atteindre 4 à 6 ℃ / s), tout en garantissant l'uniformité de La température entre les pores (erreur a ≤ 0,5 ℃), afin d'éviter l'incohérence du taux d'expansion due à la différence de température. En outre, certains équipements ont également une fonction de contrôle de la température de gradient, qui peut définir plusieurs gradients de température de recuit en même temps, ce qui facilite l'optimisation rapide des conditions de réaction pour les utilisateurs.

2. Module de détection optique: le « capteur» du signal fluorescent

Le module de détection optique est responsable de l'acquisition en temps réel du signal de fluorescence au cours de la réaction PCR, dont les performances déterminent directement la sensibilité et la spécificité de la détection. Ce module se compose principalement de trois parties: source lumineuse d'excitation, filtre, détecteur. La source de lumière d'excitation est généralement une lampe au tungstène halogéné, une lampe à led ou un laser, où la lampe à LED est largement adoptée en raison de sa longue durée de vie, de sa faible consommation d'énergie et de sa bonne stabilité; Les filtres sont divisés en filtres d'excitation et filtres d'émission pour filtrer la lumière d'excitation et d'émission à des longueurs d'onde spécifiques, en veillant à ce que seul le signal Fluorescent cible soit détecté, réduisant les interférences de fond; Le détecteur est alors utilisé pour convertir le signal de fluorescence en signal électrique, le détecteur principal est un tube photomultiplicateur (PMT) ou un dispositif à couplage de charge (CCD), où la sensibilité PMT est plus élevée, adaptée à la détection d'échantillons à faible concentration, le CCD peut réaliser une détection simultanée multicanaux, améliorant L'efficacité de la détection.

3. Module logiciel et traitement des données: le « responsable de l'analyse» des résultats de détection

Le module logiciel et traitement des données contrôle le fonctionnement de l'équipement, collecte les signaux de fluorescence et effectue le traitement analytique des données. Grâce au logiciel, l'utilisateur peut définir des paramètres tels que les paramètres du cycle PCR (nombre de cycles, température et temps de chaque phase), les canaux de détection de fluorescence, les seuils, etc.; Pendant le fonctionnement de l'appareil, le logiciel trace la courbe de fluorescence (courbe d'amplification) en temps réel; Une fois la réaction terminée, le logiciel calcule automatiquement la concentration de l'acide nucléique cible dans l'échantillon en fonction de la valeur de CT et de la courbe standard et génère un rapport de détection. En outre, le logiciel de haute qualité dispose également de fonctionnalités telles que l'exportation de données, le traitement par lots, l'analyse de contrôle de la qualité, qui peuvent répondre aux besoins de normalisation de la recherche scientifique et des tests cliniques.

　Iii. Large application du détecteur PCR quantitatif de fluorescence: osmose Multi - domaines "All - a - Energy Detection Equipment"

Le détecteur PCR quantitatif à fluorescence, avec ses avantages de détection quantitative précise, haute sensibilité et rapide, a été largement utilisé dans de nombreux domaines tels que le diagnostic clinique, l'expérimentation scientifique, la sécurité alimentaire, la surveillance de l'environnement et ainsi de suite, devenant un « concurrent énergétique complet» dans le domaine de la détection moléculaire.

1. Domaine du diagnostic clinique: un « outil privilégié » pour le dépistage et la surveillance des maladies

Dans le diagnostic clinique, le détecteur PCR quantitatif Fluorescent est l'équipement de base pour la détection des acides nucléiques et est largement utilisé dans le diagnostic et la surveillance des infections virales, des infections bactériennes, des maladies génétiques, des tumeurs et d'autres maladies. Par exemple, dans le diagnostic des infections virales, les concentrations d'acides nucléiques du nouveau coronavirus a, du virus de l'hépatite B, du virus de l'hépatite C, du virus de la grippe, etc., peuvent être rapidement détectées, ce qui permet un dépistage et un diagnostic précoces; Dans le diagnostic des maladies génétiques, des mutations génétiques, des anomalies chromosomiques, etc. peuvent être détectées, fournissant une base pour le diagnostic prénatal des maladies génétiques telles que la thalassémie, le syndrome de Down et d'autres; Dans le diagnostic des tumeurs, les niveaux d'acides nucléiques des marqueurs tumoraux, tels que les mutations du gène EGFR, peuvent être détectés pour soutenir le dépistage précoce des tumeurs, l'orientation thérapeutique ciblée et la surveillance pronostique.

2. Domaine expérimental de la recherche scientifique: un « outil fondamental» pour la recherche en biologie moléculaire

Dans la recherche scientifique en biologie moléculaire, le détecteur PCR quantitatif par fluorescence est l'équipement de base, couramment utilisé dans l'analyse du volume d'expression des gènes, la détection des variations du nombre de copies de gènes, le génotypage, la traçabilité des agents pathogènes et d'autres études. Par example, dans l'analyse du volume d'expression d'un gène, on peut comparer les différences dans son niveau d'expression en détectant les valeurs de ct du gène cible dans différents tissus ou conditions de traitement; Dans la détection des variations du nombre de copies d'un gène, on peut déterminer s'il y a une augmentation ou une diminution du nombre de copies du gène cible par rapport à la valeur ct du gène de référence interne; Dans les études de traçabilité des agents pathogènes, leur génotype et leurs relations évolutives peuvent être analysés en détectant des fragments d'acides nucléiques spécifiques des agents pathogènes.

3. Domaine de la sécurité alimentaire: une « ligne de défense» pour garantir la sécurité alimentaire

Dans le cadre de la surveillance de la salubrité des aliments, les détecteurs PCR quantitatifs à fluorescence peuvent être utilisés pour détecter les agents pathogènes (p. ex. Salmonella, E. coli, etc.), les ingrédients génétiquement modifiés, les résidus de médicaments vétérinaires, etc. dans les aliments. Par exemple, il peut rapidement détecter l'acide nucléique bactérien pathogène dans les aliments frais, les aliments transformés et détecter les dangers pour la sécurité alimentaire en temps opportun; Peut détecter des fragments génétiquement modifiés (tels que le gène cry1ac) dans des produits agricoles tels que le soja, le maïs, etc., permettant une identification précise des aliments génétiquement modifiés; Peut détecter les marqueurs d'acide nucléique résiduels tels que la protéine maigre, les antibiotiques et autres dans la viande, garantissant la sécurité de la qualité des aliments.

4. Domaine de la surveillance de l’environnement: le « moniteur» de l’environnement écologique

Dans la surveillance de l'environnement, le détecteur PCR quantitatif Fluorescent peut être utilisé pour détecter les micro - organismes (par exemple, cyanobactéries, E. coli, bactéries pathogènes, etc.), les gènes liés à la dégradation des polluants, etc. dans les échantillons environnementaux tels que les plans d'eau, le sol, l'air, etc. Par exemple, les gènes de synthèse de la toxine des cyanobactéries peuvent être détectés dans un plan d'eau, avertissant l'apparition d'une prolifération de cyanobactéries; Détecte les gènes de résistance aux métaux lourds dans le sol et évalue le degré de contamination du sol; Détecte les gènes des bactéries résistantes dans l'environnement, surveille la propagation des bactéries résistantes et fournit un support de données pour la protection de l'environnement écologique et la sécurité de la santé publique.

　Tendances de développement de l'analyseur PCR quantitatif Fluorescent: plus rapide, plus précis et plus pratique

Avec les progrès continus de la technologie de détection moléculaire, les détecteurs PCR quantitatifs par fluorescence évoluent également vers des vitesses plus rapides, plus précises, plus pratiques et à haut débit pour répondre aux besoins de détection de différents domaines.

1. Accélérer: réduire le temps de détection

La détection PCR quantitative par fluorescence traditionnelle prend généralement 1 à 2 heures et peut difficilement répondre aux besoins de détection d'urgence. La rapidité est donc devenue une tendance importante du développement. En optimisant la technologie de contrôle de la température (par exemple, en utilisant de nouveaux modes de chauffage tels que le chauffage au laser, le chauffage par micro - ondes, etc.), en augmentant la vitesse de montée et de descente de la température (jusqu'à plus de 10 ℃ / s), le temps d'un cycle individuel peut être réduit à quelques dizaines de secondes, l'ensemble du processus de détection peut être compressé à moins de 30 minutes, voire environ 15 minutes, adapté aux scénarios de détection d'urgence tels que la prévention et le contrôle des épidémies, les urgences

2. Quantification passe - haut: améliorer l'efficacité de détection

Pour répondre à la demande de détection d'échantillons à grande échelle, la quantification Qualcomm est devenue la direction principale du développement. À l'heure actuelle, le canal de détection de l'équipement grand public a été augmenté de 96 à 384 puits, voire 1536 puits, ce qui permet de détecter simultanément un grand nombre d'échantillons, améliorant considérablement l'efficacité de la détection. En outre, l'application de la technologie de détection multicanaux (par exemple, 6 canaux, 8 canaux), qui permet la détection simultanée de plusieurs cibles dans un seul échantillon, réduit l'utilisation de l'échantillon et le temps de détection, convient aux scénarios de dépistage combiné Multi - agents pathogènes, génotypage, etc.

3. Miniaturisation et portabilité: élargir les scénarios d'application

Les détecteurs PCR quantitatifs à fluorescence traditionnels sont volumineux et dépendent d'un environnement de laboratoire, ce qui les rend difficiles à répondre aux besoins de détection sur le terrain. Par conséquent, la miniaturisation, la portabilité deviennent des orientations de développement importantes. Grâce à l'intégration de la technologie microfluidique, des modules optiques miniatures, des systèmes embarqués, etc., un détecteur PCR quantitatif Fluorescent portable a été développé, avec une taille compacte et un poids léger (peut être transporté partout), aucun équipement de laboratoire complexe n'est nécessaire, peut compléter l'essai d'échantillon directement sur le site, adapté à la médecine de base, à la surveillance sur le terrain, à la quarantaine portuaire et à d'autres scénarios.

4. Intelligence et automatisation: abaisser le seuil de fonctionnement

L'intelligence et l'automatisation sont essentielles pour améliorer la facilité et la stabilité de la détection. Grâce à l'intégration de modules automatisés de traitement des échantillons (par exemple, extraction automatique d'acides nucléiques, dosage automatique), l'automatisation complète du processus, du prétraitement des échantillons à la sortie des résultats de détection, réduit les erreurs opérationnelles humaines et réduit les exigences professionnelles pour les opérateurs. Dans le même temps, la combinaison d'algorithmes d'intelligence artificielle peut permettre l'optimisation automatique des paramètres de détection, l'analyse intelligente de la courbe de fluorescence, l'identification automatique des échantillons anormaux, améliorant encore la précision et la fiabilité de la détection.

5. Fusion avec d'autres technologies: élargir les limites de détection

La fusion de la technologie PCR quantitative par fluorescence avec d'autres techniques de biologie moléculaire peut élargir les limites de la détection. Par exemple, la fusion avec la technologie PCR numérique permet la quantification au niveau d'une seule molécule, améliore la sensibilité de détection et convient à la détection d'échantillons d'acides nucléiques de faible abondance (p. ex., diagnostic précoce des tumeurs, détection de micro - agents pathogènes); La fusion avec la technologie de séquençage permet une double détection "quantitative + qualitative" qui permet non seulement de déterminer la concentration de l'acide nucléique cible, mais également d'analyser ses informations de séquence, applicables à des scénarios tels que la traçabilité des agents pathogènes, l'analyse précise des mutations génétiques, etc.

Le détecteur PCR quantitatif à fluorescence, en tant qu'équipement de base dans le domaine de la détection moléculaire, est devenu une « règle de précision» dans les domaines de l'innovation scientifique, du diagnostic clinique, de la sécurité alimentaire, de la surveillance de l'environnement et d'autres domaines, grâce à ses avantages quantitatifs précis, haute sensibilité et largement applicables. Avec les progrès continus de la technologie, les détecteurs PCR quantitatifs à fluorescence évolueront vers une vitesse, une précision, une commodité et un débit plus élevés, élargissant davantage les scénarios d'application et fournissant un support technique plus solide pour la recherche en sciences de la vie et la sécurité de la santé publique. À l'avenir, que ce soit la recherche de précision dans les laboratoires de recherche scientifique ou le diagnostic rapide des soins de santé de base, il ne sera pas possible de promouvoir la technologie de détection moléculaire pour mieux servir la santé humaine et le développement social.